RD-Biotech propose tout un panel de services sur mesure sur sa plateforme d’ingénierie des anticorps. En vous adressant à RD-Biotech, vous allez :
Bioproduction
Anticorps monoclonaux murins, rat, cobaye, ou autres espèces. Capacités jusqu’à plusieurs dizaines de grammes.
RD-Biotech a développé un savoir-faire reconnu dans le développement et la production in vitro d’anticorps monoclonaux.
La production en ascites, toujours autorisée en France, est reconnue comme très pénible pour les animaux et elle peut aujourd’hui être avantageusement remplacée par la culture cellulaire. Avec son unité de production in vitro, RD-Biotech propose des technologies alternatives à un coût équivalent aux productions en ascites et ce avec une reproductibilité et une qualité de pureté bien supérieures aux productions en ascites.
Lorsque le client confie son clone à RD-Biotech (flasques ou cryotubes) pour une production in vitro, il n’est pas nécessaire de préciser la spécificité du clone, ce qui garantit la confidentialité envers le client.
Avec plus de 500 clones produits chaque année, RD-Biotech a développé une expertise sans égal dans la production d’anticorps monoclonaux, pour des applications en recherche ou des études précliniques.
Que vous souhaitiez 1 mg d’anticorps purifiés pour une étude en R&D ou 500 mg «endofree» pour des applications in vivo, notre but est de répondre à votre demande, en termes de quantité, de qualité et de délais.
Différents grades de qualité, adaptés à vos applications :
Grade Recherche & Développement « endofree »
Pour vos applications en R&D et précliniques.
- Grande capacité de production : de quelques milligrammes jusqu’à plusieurs grammes. QUANTITÉ GARANTIE !
- Hybridomes de souris, de rat, de cobaye, ou autres espèces
- Délais très courts
- Homogénéité des lots produits
- Possibilité de gardiennage sécurisé pour des productions récurrentes
- Adaptation du process en cas de clones mauvais producteurs
- Contrôles qualité standards inclus sans frais supplémentaires : Dosage des protéines totales par mesure au spectrophotomètre (étalon Ig) et analyse des protéines totales par électrophorèse de SDS-PAGE.
- Qualité «Endofree» (Qualité injectable) : Nous garantissons un niveau d’endotoxines inférieur à 1 EU/ mg d’Ig (utilisation de tampons apyrogènes, récolte en conditions stériles, sanitisation du matériel, conditions de purification apyrogènes, test LAL)
- Adaptation à un milieu de culture spécifique
- Concentration du surnageant
- Ajustement de la concentration d’anticorps
- Filtration
- Aliquotage
- Contrôles qualité supplémentaires, hors forfait standard
- Contrôles de spécificité, d’activité biologique…
- Modification des anticorps : fragmentation, couplage…
- Séquençage pour sécuriser l’anticorps ou pour un passage en recombinants
- Anticorps à activité biologique
- Intégration dans un kit de diagnostic in vitro
- Utilisation en recherche
- Candidats dans le cadre de programmes thérapeutiques
- Contrôles de vaccins
- Standards de références
Grade High Quality ou GMP “like”
Production d’anticorps monoclonaux de qualité supérieure, adaptée pour des applications précliniques.
- Traçabilité complète et documentation concernant les réactifs et les opérateurs
- Culture à grande échelle réalisée sans antibiotiques
- Le processus de production est réalisé sans substances d’origine animale, “animal free”.
- Conservation de la banque cellulaire en zone sécurisée
- Des contrôles supplémentaires sont appliqués pour garantir une pureté maximale du produit
- Contrôles qualité adaptés au cahier des charges du donneur d’ordre et à la (liste des CQ sur demande)
Production in vitro d’anticorps monoclonaux
Les différentes étapes d’un programme de production d’anticorps in vitro sont les suivantes :
Le client fournit l’hybridome (cellules congelées ou cellules en culture) accompagné d’une fiche technique dans laquelle seront précisés le milieu de culture, la nature et l’isotype de l’anticorps. L’hybridome peut être adapté à différents milieux de culture (milieu sans sérum, sérum déplété en IgG bovines, …). L’anticorps peut être produit et purifié en conditions “endofree”.
Pour de grandes quantités d’anticorps monoclonaux à produire (au-delà de 100 mg) RD-Biotech peut proposer une évaluation de la productivité sur de petits volumes (étape pilote).
A l’issue de cette phase de faisabilité, le client reçoit un rapport indiquant la productivité obtenue in vitro et un devis précis et ferme pour la phase production. Il peut recevoir également l’anticorps pour l’évaluer avant de commander la phase production in vitro.
Phase de production in vitro sur des volumes pouvant aller de 1 litre à plus de 300 litres de surnageant de culture, ce qui permet de produire de quelques mg à plusieurs dizaines de grammes d’anticorps in vitro.
Différentes technologies de production sont disponibles, permettant d’adapter les conditions de culture au clone (selon sa productivité, la quantité souhaitée…) : production en Rollers ou T-Flasks, possibilité de produire en FiberCell, Spinners ou CELLine tm.
Grâce aux kits de dosage des IgG de souris, IgG de rat et IgG humaines[SM3] développés et commercialisés par RD-Biotech (gamme FastELISA), nous pouvons suivre la production des anticorps dans le surnageant de culture afin d’estimer très rapidement la quantité de surnageant à produire pour atteindre l’objectif défini.
Le surnageant produit peut être ensuite concentré jusque 15 fois par ultrafiltration tangentielle.
Envoi du surnageant au client si il le souhaite ou réalisation de la purification de l’anticorps monoclonal par RD-Biotech.
Purification d’anticorps
Purification des anticorps monoclonaux (Immunoglobulines IgG, IgM, IgA, IgY…) :
Purification à partir du sérum, du plasma, du surnageant de culture ou du jaune d’œuf.
Grâce à la technique FastELISA de dosage des IgG de souris, des IgG de rat ou des IgG humaine, RD-Biotech peut très rapidement contrôler le taux d’immunoglobulines G dans l’échantillon et estimer la quantité qu’il sera possible de purifier.
- Purification des anticorps monoclonaux par chromatographie d’affinité sur Protéine A, Protéine G, ou autre résine d’affinité, selon l’origine et l’isotype du clone (IgG, IgA, …)
- Purification par chromatographie échangeuse d’ions, notamment pour la purification d’IgM
- Purification par affinité spécifique : permettant d’isoler à partir d’un ligand spécifique (peptide, antigène…)
- Purification par précipitation, par exemple au sulfate d’ammonium
- Purification par gel filtration
Après l’étape de chromatographie d’affinité, la pureté de l’anticorps peut être améliorée par différentes méthodes :
- Par une étape de chromatographie d’exclusion stérique (SEC préparative) qui permettra d’éliminer les agrégats ;
- Par une étape de chromatographie d’échange d’ions, qui élimine également les endotoxines éventuellement présentes.
L’anticorps produit in vitro peut être purifié en conditions Endofree, ce qui nécessite l’usage de tampons et contenants apyrogènes. Les anticorps monoclonaux produits in vitro par RD-Biotech en conditions Endofree ont un taux d’endotoxines inférieur à 1 EU/mg.
Contrôles qualité
Le forfait standard inclut les contrôles suivants garantissant la qualité des anticorps produits et/ou purifiés
- Analyse des protéines totales par électrophorèse de SDS-PAGE
- Dosage des protéines totales par mesure d’absorbance au spectrophotomètre (standard Ig adapté à l’isotype)
Les anticorps monoclonaux produits in vitro peuvent être livrés au client après concentration et équilibrage dans le tampon souhaité, accompagné d’un rapport de purification complet.
- Test mycoplasmes
- Test LAL permettant de déterminer le taux d’endotoxines bactériennes. Le test LAL (Limulus Amebocyte Lysate) est réalisé à l’aide d’un kit réglementaire selon le protocole du fournisseur.
- Test de non contamination bactérienne et fongique
- Contrôle par SEC analytique
- Dessalage des anticorps
- Contrôle de spécificité, d’activité biologique… (ELISA, Western Blotting, Octet, Cytométrie, bioessais à façon…)
- Dosage des résidus Protéine A (Kit RD-Biotech FastELISA)
- Dosage des contaminants Ig bovines (Kit RD-Biotech FastELISA)
Dans le cadre de purification selon un process « High Quality Grade », des contrôles spécifiques seront appliqués
Banques cellulaires
Banques maîtresses et banques de travail
Réalisation à façon des banques de sauvegarde des hybridomes
- à partir de cellules fournies en culture ou congelées
- lors de la phase d’amplification des cellules avant production
- ou à l’issue d’un programme de développement de nouveaux clones.
- Amplification des cellules
- Si nécessaire, réalisation d’un test de productivité avec le Kit FastELISA .
- Congélation des cellules en phase de croissance exponentielle avec une viabilité de 100% : 10 ampoules de 5 millions de cellules
- Contrôles de banques (viabilité cellulaire et absence de contamination par mycoplasmes)
- Congélation des cryotubes à -80°C et à l’azote avant expédition chez le client, accompagnées du certificat de contrôles.
- Possibilité de gardiennage d’une partie des ampoules pour des productions récurrentes:
- Conservation en azote liquide (zone contrôlée)
- Contrôle de stabilité des banques durant la période de gardiennage (productivité et spécificité)
Couplage d’anticorps
Couplage, Fragmentation et autres modifications
RD-Biotech réalise la fragmentation de l’anticorps monoclonal ou de l’anticorps polyclonal (pepsine, papaïne…) et/ ou le couplage des anticorps par différents marqueurs :
- marquage par Peroxydase (HRP)
- marquage par Phosphatase alcaline (PAL)
- marquage par Biotine
- marquage par un marqueur fluorescent (Fluoresceine FITC, Cyanine, Alexa fluor …)
Les couplages sont réalisés selon des protocoles robustes, pratiqués en routine par nos équipes.
Après modification de l’anticorps et contrôle qualité, l’échantillon est expédié chez le client accompagné d’un rapport.
Plateforme LUMINEX
Accord de partenariat avec Luminex Corporation
RD-Biotech propose désormais une gamme de services personnalisés avec la technologie Luminex xMAP®!
- Couplage antigène ou anticorps avec des billes Luminex
- Service analytique : détection et quantification des analytes, analyse mono ou multiplexe à l’aide de l’équipement Luminex 200
- Développement de tests multiparamétriques
De la fourniture d’analytes greffés à des billes Luminex jusqu’au développement de tests !
Avantages de la technologie Luminex :
- Analyse multiplexe jusqu’à 100 analytes
- Haute sensibilité
- Faible volume d’échantillon
- Interférence de matrice limitée
- Analyse très rapide
Développement d’anticorps monoclonaux
RD-Biotech propose de prendre en charge vos projets d’anticorps monoclonaux chez la souris, avec fourniture des clones en banques cellulaires.
Notre expertise technique et scientifique, alliée à celle de nos sociétés sœurs, nous permettent de proposer :
- la prise en charge l’expression des antigènes (analyse de séquences, préparation de peptides ou de protéines recombinantes)
Découvrir protéines recombinantes - une plateforme de criblages étendue : ELISA, Western Blotting, Cytométrie, Octet…
Découvrir services analytiques - la caractérisation des anticorps monoclonaux développés : spécificité, affinité, bio activité
Découvrir services analytiques - l’expertise et les outils technologiques pour sécuriser votre clone ou pour passer en anticorps recombinants (séquençage de l’anticorps, chimérisation, humanisation,….)
Découvrir anticorps recombinants - la génération d’hybridomes dans d’autres espèces (rat, cobaye)
- les technologies de Phage Display (souris, rat, autres espèces)
Les différentes étapes d’un programme d’immunisation et génération d’hybridomes sont décrites ci-dessous, sur la base d’un fonctionnement Go No Go. Avant tout démarrage d’un nouveau projet, RD-Biotech conseille une réunion préparatoire qui va permettre de valider les différentes étapes du process : antigènes, voies d’immunisation, choix de l’hôte, mode de criblages, criblage différentiel…
Préparation de l’immunogène
Matériel de départ fourni par le client :
- L’immunogène ou les immunogènes : protéine d’intérêt, native ou recombinante, peptide, séquence peptidique sur fichier informatique, …
- Les molécules nécessaires aux étapes de criblage (anticorps, protéines peptides, lysat cellulaire…)
RD-Biotech peut également prendre en charge la préparation de ou des immunogènes
- Etude de faisabilité : design de l’antigène, analyse de séquences, optimisation, …
- Production de l’immunogène, couplage à un carrier, …
Génération des hybridomes
- Immunisation de 4 souris (forfait standard pouvant être adapté en fonction du projet)
- Immunisation des souris par voie intrapéritonéale / programme 49 jours ou par voie intrapodale / programme 28 jours
- Nombre d’injections et de boosts adapté au protocole d’immunisation.
- La réponse immunitaire est suivie par titration ELISA ou Western-blotting.
- Les résultats sont envoyés au client.
- Go No Go : validation des résultats de titration par le client
- La fusion est réalisée après sélection des souris en accord avec le client.
- Entretien des hybridomes sur milieu sélectif
- Criblage des surnageants de tous les hybridomes par ELISA
- D’autres méthodes peuvent être proposées : Dot-Blot, western blotting, cytométrie de flux, Octet ou autres méthodes.
Découvrir les services analytiques - Après criblage, les hybridomes positifs sont repiqués pour contrôle secondaire
- Isotypage et sauvegarde des hybridomes significativement positifs
- Possibilité d’envoi de surnageants positifs au client pour la réalisation de tests additionnels et pour la sélection des hybridomes les plus performants.
- Criblage des surnageants après chaque série de clonage (ELISA ou autres méthodes au choix)
- Une attention particulière est prise dès les premières étapes de clonages afin d’éviter les pertes d’hybrides d’intérêt mais instables avant le stade monoclonale:
- Isotypage des clones (Kit FastELISA rdb-3255)
- Si besoin, préparation de miniproductions et envoi au client pour contrôles additionnels.
- Pour chaque clone sélectionné, constitution de Banques maîtresses avec congélation de 10 ampoules de 5 millions de cellules.
- Des ampoules supplémentaires sont préparées pour les contrôles de banques (viabilité à la décongélation et absence de contamination par les mycoplasmes)
- Gardiennage des banques (à préciser)
Séquençage des anticorps monoclonaux
Sauvegarde des clones : Le séquençage peut être proposé dès les premiers stades du processus, pour sécuriser les clones
Développement d’anticorps recombinants : Le séquençage peut permettre le développement d’anticorps recombinants
Caractérisation des candidats
RD-Biotech propose différentes méthodes pour la caractérisation des candidats : spécificité, activité biologique…
- ELISA
- Western Blotting
- Cytométrie de flux
- Octet
- Plateforme de bioessais (ADCC, CDC…)
Rescue des clones
Différentes stratégies peuvent être mises en place, notamment le reclonage des clones d’intérêt.
Développement et production d’anticorps polyclonaux
RD-Biotech développe des anticorps polyclonaux à façon à partir de différents types d’immunogènes (protéine purifiée, peptide, lysat cellulaire…).
L’espèce la plus utilisée est le lapin, mais nous avons la possibilité également de développer des anticorps de poule (IgY).
Autres services
Notre équipe commerciale ainsi que nos experts scientifiques et techniques sont à votre écoute pour vous proposer le service adapté à votre demande.